Разрушительную революцию принес России ХХ век. Новой власти оказалось ненужным богатейшее духовное наследие прошлого, собранное многими поколениями. Для Русской Православной Церкви наступило время тяжелого крестоношения, когда миру были явлены сонмы новомучеников и исповедников Христовых.

Сразу после октябрьского переворота по России прокатилась волна вскрытий мощей святых угодников Божьих. 25 февраля 1919 года были кощунственно вскрыты и мощи преподобного Нила. А позднее их вывезли из обители и поместили в Вознесенском храме уже закрытого Знаменского монастыря города Осташкова, в котором разместилась экспозиция местного краеведческого музея. Все драгоценности Ниловой пустыни новые властители изъяли, обитель была разграблена. Все же Нилова пустынь продолжала существовать еще несколько лет. В 20-е годы, с целью закрыть монастырь, властями был устроен судебный процесс над братией монастыря во главе с архимандритом Иоанникием (Поповым) и осташковским викарным епископом Гавриилом (Аболымовым). Вскоре в обители не осталось ни одного монаха, лишь архивы НКВД могут поведать о дальнейших их судьбах. Последняя Литургия была отслужена в монастыре в 1928 году.

Среди исповедников православной веры был и постриженик Ниловой пустыни схиигумен Михаил. Он принял постриг и подвизался в обители по благословению св. прав. отца Иоанна Кронштадтского. В 1927 году, когда начались гонения и притеснения монахов, отец Михаил перешел в более отдаленную обитель — Новосоловецкую пустынь. Там он пробыл до начала 30-х годов, а потом вынужден был скитаться по деревням и жить у своих духовных чад. Отец Михаил имел дар прозорливости и исцеления болезней. Его почитали в народе как опытного духовника и старца.

В середине 30-х годов отец Михаил поселился у реки Серемхи, на месте первых пустынных подвигов преподобного Нила. Служил здесь сначала в храме, а когда тот закрыли — тайно, у себя в келье. Келейница отца Михаила однажды видела его во время молитвы стоящим на воздухе, о чем он при своей жизни запретил рассказывать. Смерть свою старец предвидел и готовился к ней. Умер батюшка 13 (26) мая 1941 года в понедельник, когда отмечается память всех Небесных Сил Бесплотных.

За время советской власти на территории монастыря размещалась и трудовая коммуна, и колония малолетних преступников. С сентября 1939 по май 1940 года здесь содержались в заключении польские военнопленные. Во время Великой Отечественной войны на острове размещался госпиталь, потом, до начала 60-х годов, — колония для несовершеннолетних преступников, позднее, — дом престарелых. В 60-е годы государство взяло комплекс монастыря под охрану как памятник архитектуры. С 1971 года обитель перешла в ведение Центрального совета по туризму и экскурсиям ВЦСПС, и здесь открылась турбаза «Рассвет».

К концу 80-х годов монастырь стоял уже брошенный, так как без восстановительных работ, требующих вложения больших средств, здания монастыря использовать было уже невозможно.