XIX век стал временем бурного развития монастыря. Несмотря на трудности, связанные с проведением церковно-государственных реформ, монастырь активно возрастал и был настоящим духовным центром.   Внутреннее устройство Ниловой пустыни оставалось тем же, что и в древности. Подвиг схимников, старцев, благолепное Богослужение, свершаемое братией благоговейно и чинно, трудолюбие иноков, как и прежде, украшали монастырь на Столобном острове. Прекрасный обычай безвозмездного приема богомольцев исполнялся строго.

Слава Ниловой пустыни как монастыря внутренне устроенного сохранялась, что привлекало в обитель многих паломников. Пустынь имела многочисленных благотворителей; среди них — бояре Петр Иванович Челищев, Мария Ивановна Рукина, Евгений Петрович Беклемишев, графиня Анна Алексеевна Орлова, Дмитрий Нилович Казин, Анна Герасимовна Серебрякова, Варвара Павловна Муромцева, Стефан Дмитриевич Воронин, купец Андрей Тимофеевич Жданов, постриженник Ниловой пустыни; архимандрит московского Донского монастыря Иоанн Терликов.

Важным событием в истории монастыря в XIX веке явилось посещение обители 12 июля 1820 года императором Александром I, который заехал сюда во время своего путешествия по Северу России. Это событие было описано протоиереем Феодором Прусавецким, благочинным Троицкого собора города Осташкова. Государя встречал архимандрит пустыни Павел с братией.

Александр I посетил собор, поклонился святым мощам преподобного Нила Столобенского Чудотворца, а после литургии побывал во всех храмах Ниловой пустыни и был принят настоятелем в своих покоях. За соблюдение высоких духовных традиций, за благоустройство пустыни государь пожаловал в ризницу золотую панагию (небольшую нагрудную иконку) на золотой цепочке, украшенную бриллиантами. Архимандриту Павлу Александр I подарил наперсный (нагрудный) золотой крест с драгоценными камнями.

Девятнадцатый век многое изменил в Ниловой пустыни: монастырь превратился в большой архитектурный комплекс, облик которого определяли грандиозный Богоявленский собор, архиерейские покои, двухэтажные здания гостиницы и странноприимного дома. Высокая гранитная набережная, укреплявшая остров, сделала Нилову пустынь похожей на городскую столичную площадь.

Но как и раньше, в XVIII веке, по указу Святейшего Синода в пустыни содержалось 30 иноков и 30 послушников.

Несмотря на то, что у Ниловой пустыни в результате монастырских реформ земли не изымались, их количество по отношению к концу XVIII века уменьшилось с 4700 до 2700 гектаров — почти в два раза.

Сокращение землевладений Ниловой пустыни было связано с изменением хозяйственно-экономической деятельности обители в новых условиях. Как и в прежние времена, монастырь продолжал в XIX веке владеть только пустошами или полупустошами. Но в некоторых из них были построены храмы, часовни, жилые (для трудников и наемных работников) каменные дома, добротные каменные строения. Подобные места стали называться посельями. Так, в 1826—1828 годах на средства вышневолоцкой помещицы Марии Ивановны Рукиной на Светлице возвели каменную церковь во имя Архангела Михаила с приделами Святой равноапостольной Марии Магдалины и Святых Жен Мироносиц. Близ храма построили деревянный дом, где находилась монастырская больница. К северу от больницы находились яблоневый сад и овощной огород, обнесенные деревянным на каменных столбах забором, а также каменная сторожка и навес для дров. Близ сада в 1904—1906 годах монастырь построил двухэтажное каменное здание школы для крестьянских детей окрестных селений. На Светлице был скотный двор с двумя сараями, каменное здание прачечной.

Большое значение в хозяйстве Ниловой пустыни уделяли транспорту, дорогам, мостам. Появившийся в Верхневолжье в 1859 году первый пароход принадлежал монастырю, а выделил средства на его приобретение выходец из Осташкова, коллежский советник Стефан Дмитриевич Воронин. Владела пустынь лодками; на острове Столобное, на берегу залива, имелась специальная ремонтная мастерская. Конные повозки размещались на конном дворе монастыря, в северо-западной части острова. В 1905 году построили деревянный мост, соединивший Нилову пустынь с полуостровом и монастырским посельем Светлицей.

   В XIX веке улучшается материальное положение Ниловой пустыни. В сохранившихся источниках описывается хозяйственная деятельность монастыря: «в царствование Благочестивейшего Государя Императора Александра Первого, старанием Настоятеля Архимандрита Павла, по здешней обители сделано и построено (в 1803 году) следующее: в здешнего озера Селигера, называемом Лукою, сделана плотина для садка в оную различной рыбы. В 1804 года внутри монастыря, под кухнею, хлебнею и квасоварнею, надстроен верхний каменный этаж. В 1809 году, вне монастыря в гостином дворе, двухэтажные старые кельи разобраны и построен новый трехэтажный корпус».

   Можно сказать, что хозяйственно-экономические отношения Нило-Столобенской пустыни в XIX — начале XX века имели свои особенности. Хозяйство монастыря по структуре было многоплановым: оно включало промыслы, сельское производство, строительное дело, садоводство и огородничество, торговлю, банковый капитал, широко использовалась сдача в аренду недвижимости. Хозяйство эффективное, рентабельное, включало современную технику и технологию, а также являлось экологически чистым, поэтому оно служило для многих других владельцев достойным образцом.