После обретения святых мощей преподобного Нила благоволение к монастырю царственных особ и государственных сановников вплоть до начала следующего столетия по-прежнему не уменьшалось. Благодаря богатым вкладам в казну монастыря и всевозможным пожертвованиям, задуманное святителем Нектарием возведение каменных зданий продолжалось его преемниками успешно. Но в начале XVIII века, в связи с новой государственной политикой по отношению к Церкви, монастыри попали в стесненные условия и не могли свободно развиваться. Строительство в Ниловой пустыни замедлилось, а число насельников сократилось.

Тяжелые испытания для Нило-Столобенской пустыни, как и всем монастырям России, принес XVIII век, начинавшийся преобразованиями Петра I. В Новое время появились новые идеи, сложилась система абсолютного государственного верховенства над Церковью. Особенно резкие меры принимались против монастырей. Петр I называл их «гангреной государства», а монахов считал тунеядцами и плутами.

Новшества петровского времени в Ниловой пустыни проявились, вероятно, особенно болезненно: в монастыре на острове Столобное был введен полицейский надзор, который осуществлял Пахомий Никитин, монах-инквизитор, как его называли. А. В. Рачинский отмечал, что Пахомий вмешивался во все дела обители, ввел развращающую монастырскую общину систему доносов. Пахомий пользовался большими льготами в монастыре,

но в конце концов за свое аморальное поведение был отозван в Санкт-Петербург.

В XVIII столетии на остров Столобное, отдаленный от столиц и крупных городов, власть ссылала под надзор неугодных ей политических и церковных деятелей. Среди них оказался митрополит Крутицкий Игнатий, в 1712—1719 годах являвшийся епископом Суздальским и Владимирским. Он поддерживал первую жену Петра I царицу Евдокию Федоровну Лопухину, насильно постриженную в Покровский монастырь в Суздале. Владыка Игнатий был наказан за то, что отдавал ей почести как царице. Он неодобрительно отзывался об устраиваемых царем «всешутейших» и «всепьянейших» соборах, когда высмеивалось священное имя патриарха, когда все канонические слова и обрядовое церковное действо во имя Духа Святого совершалось и произносилось во имя бога вина Бахуса. Митрополит Крутицкий Игнатий находился под надзором в Ниловой пустыни с 1721 по 1727 год.

На остров Столобное был сослан бывший епископ Карельский Аарон, он находился здесь с 1723 по 1727 и с 1730 по 1740 год. Но даже в ссылке оставили по себе эти люди добрую память. Митрополит Крутицкий Игнатий укрепил берег острова дубовыми сваями, которые сохранились до сего времени. Владыка привел в порядок рощу на острове; работал сам, а также на собственные деньги нанимал работников. После окончания ссылки он присылал в Нилову пустынь деньги на строительство храмов и для приема богомольцев. Епископ Карельский Аарон помог Ниловой пустыни получить от императрицы Анны Иоанновны значительные пожертвования.

В 1736 году игумен Ниловой пустыни Иларион, иеромонах Гурий, иеродиаконы Ипполит, Феодосий, Макарий, монах Анисим были сосланы в Сибирь, где находились до 1744 года. Их наказали за то, что в пустынь постригали молодых послушников, а не инвалидов и отставных солдат, как этого требовал указ Петра I.

Первый российский император боролся с монастырями не только политическими и административными мерами, но и экономическими. Обители не получали казенного содержания, которое им полагалось. Вместо этого в 1720 году был принят указ Сената о передаче в пользование Ниловой пустыни всего озера Селигер. Полученный доход Нилова пустынь должна была направлять в Ржевскую воеводскую канцелярию, а также на содержание Знаменского женского монастыря в Осташкове. Для обители, имевшей немного работников и трудников, было сложно организовывать лов рыбы на всем Селигере и сдавать в оброчное пользование озеро, поэтому в 1734 году пустынь отказалась от Селигера, стала получать вновь денежное содержание от казны.

Монастырь очень гибко организовывал свое хозяйство. В 1728 году он продал принадлежавшие ему в Новгороде подворье с землей, огородом и садом. Это объяснялось тем, что изменились деловые связи обители, они все более ориентировались на новую северную столицу.

Самые большие доходы Нилова пустынь имела от сдачи озера Селигер в аренду рыбакам. На втором месте были пожертвования богомольцев в кружку у святых мощей преподобного Нила Столобенского Чудотворца; на третьем — доходы от продажи рыбы; все остальные статьи дохода были незначительными.

Именно это определяло специфику хозяйственно-экономических условий Ниловой пустыни. Самые крупные расходы были связаны с приобретением хлеба и столовых припасов, так как монастырь содержал трудников, работников и их семьи, а также бесплатно принимал паломников и богомольцев.

Даже в один из самых сложных периодов XVIII столетия, когда начинались монастырские реформы, имевшие неблагоприятные последствия, монастырское хозяйство было рентабельным.

Естественно, что строительство на острове Столобное в петровское время и в середине XVIII столетия почти прекратилось. Но зато вторая половина века стала временем расцвета Ниловой пустыни. На острове Столобное велось большое каменное строительство. К 1790 году пустынь имела 4769 десятин земли, что составляло почти 5300 гектаров, а также продолжала владеть правом рыбной ловли на озерах Селигер, Ильмень, на реках Черемухе, Тихминке, Каменке, двумя мукомольными водяными мельницами на реке Сороге, на пустоши Кокоткино, в 10 км от монастыря, и на реке Сиговке, на пустоши Зимницы, в 20 км от него. С 1702 по 1768 год, кроме этого, Нилова пустынь владела мельницей на реке Емше, неподалеку от города Осташкова; в 1713—1730 годы упоминалась также еще одна мельница в поселье Раменье.

В XVIII столетии монастырь значительно расширил свои землевладения: у него появились остров Жеравка, пустошь Засеремье, Прудцы, Васьково, пустошь при деревне Гришкино.

1756 год ознаменовался радостным для монастыря событием. По благословению Св. Синода совершилось общецерковное прославление преподобного Нила Столобенского. Его имя поместили в святцах наравне с прочими святыми. Службу преподобному Нилу с этого времени стали печатать в богослужебных книгах. А житие, сокращенно изложенное в Прологе, внесли в том же виде в Четьи-Минеи. В том же году грамотой епархиального архиерея было разрешено ежегодно в праздник обретения святых мощей преподобного Нила крестным ходом обносить их вокруг монастыря, к чему впоследствии присоединился и крестный ход из Осташкова. Довершил прославление святого осташковский протоиерей Андрей Колоколов, написавший ему акафист.

Какие бы испытания в XVIII столетии ни претерпела Нилова пустынь, в ней постоянным и неизменным оставались Святыни: мощи преподобного Нила Столобенского Чудотворца, у которых свершались чудеса исцеления; чудотворная келейная икона Святого — Владимирский-Селигерский образ Богоматери, а также чудотворный надгробный образ Преподобного. Во время свирепствовавшей в Осташкове и уезде холеры икону Нила Столобенского обносили вокруг острова Столобное, брали для службы в город. И тут ощущалось благодатное предстательство преподобного Нила Столобенского: обитель всегда была открыта для паломников, но в монастыре не умер ни один из иноков, хотя в округе хоронили многих. В самом Осташкове после принесения иконы и молебна Преподобному болезнь ослабла. В конце XVIII века в Ниловой пустыни был изготовлен первый скульптурный образ Святого, который также почитался как чудотворный, многим приносил исцеление. Святейший Синод Русской Православной Церкви, Тверской епископ постоянно проверяли внутреннее устройство пустыни, которое, в первую очередь, связывалось с соблюдением общежительного устава. По поручению Синода Тверской епископ Тихон, проверявший обитель, в конце XVIII века сделал следующее донесение: -Поведение обитающих в Ниловой пустыни под присмотром настоятеля вполне соответствует монашескому житию общежительному-.

В монастыре постоянно «подтверждалось» соблюдение древнего устава Богослужения, исполнение заповеди игумена Нектария о неупотреблении вина и сохранении издавна введенного порядка бесплатного приема богомольцев и паломников. Расписание часов Богослужения из древнего устава, заповедь Нектария о неупотреблении вина были отдельно написаны полууставом и помещены в трапезной, где каждую неделю читались братии во время обеда «для славы Божией и Святого Угодника, для чести Святой обители и для спасения души».